タイの伝統的な発酵大豆のマイクロバイオーム分析により、短いことが明らかになった

Scientific Reports volume 13、記事番号: 7573 (2023) この記事を引用

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2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

トゥアナオはタイの伝統的な大豆発酵食品であり、低価格のプロテインサプリメントです。 この研究は、タイ北部のトゥアナオの細菌群集を評価し、潜在的に活性な短鎖脂肪酸（SCFA）関連細菌を評価することを目的としていました。 チェンライ、チェンマイ、メーホンソン、ランパーン、ランプーン、パヤオの 6 つの県から、30 個の湿潤サンプルと 35 個の乾燥サンプルからなる 65 個のトゥア ナオが収集されました。 細菌の多様性は、乾燥サンプルよりも湿潤サンプルの方が有意に高かった。 優勢な門は、ファーミクテス属 (92.7%)、プロテオバクテリア (6.7%)、アクチノバクテリオタ属 (0.42%)、およびバクテロイド門 (0.26%) でした。 バチルス属 (67%) がすべてのサンプルで最も多く存在しました。 湿ったサンプルには、ラクトバチルス、エンテロコッカス、およびグロビカテラが豊富に含まれていました。 SCFAと微生物叢の関係を評価すると、酪酸塩およびプロピオン酸塩の濃度が高いとクロストリジウム属の存在量の増加と関連し、酢酸塩の濃度が高いとワイセラ属の存在量の増加と関連することが明らかになりました。 湿潤製品には、乾燥製品よりも酢酸塩 (P = 2.8e−08)、プロピオン酸塩 (P = 0.0044)、酪酸塩 (P = 0.0021)、イソ吉草酸塩 (P = 0.017) などの SCFA が多く含まれていました。 これらの結果は、Thua Nao における SCFA と微生物叢の関連性についての洞察を提供し、これにより SCFA が豊富な Thua Nao 生産のためのスターター培養物の開発が可能になる可能性があります。

トゥアナオ（発酵大豆）は栄養価の高いタイ北部の食品で、日本の納豆、韓国のチョンクジャン、インドのキネマなどの製品に似ています1。 トゥア ナオの製造には 3 つの主な材料 (大豆、水、天然微生物) が必要で、浸漬、煮沸、発酵、後発酵という 4 つの主要なステップで行われます。 煮沸することで非耐熱性の菌や細菌が死滅し、耐熱性の菌が保存されます。 発酵プロセスは周囲条件下で3日間続きます。 作りたてまたは濡れたトゥア ナオは、食べる前に蒸したりローストしたりできます。 周囲条件下では、濡れたトゥア ナオは約 2 日間保存できます。 したがって、保存期間を延ばすために発酵後プロセスが開発されました。 たとえば、調理済みのトゥア ナオを円形の平らなディスクにすりつぶしてから天日乾燥すると、乾燥した形態のトゥア ナオが得られ、数か月間保存できます1。

以前の研究では、生物活性化合物や健康増進化合物の潜在的な資源としてのトゥア ナオの価値が実証されました2。 トゥア ナオには、水分 57.22 ～ 64.78%、灰分 4.70 ～ 5.44%、粗繊維 12.92 ～ 28.06%、粗タンパク質 38.94 ～ 42.06%、脂肪 20.37 ～ 25.22% が含まれています3。 フェノール化合物や抗酸化活性などの生理活性化合物の潜在的な利点は、原材料に由来するだけでなく、大豆発酵中に細菌からも放出されます3。 培養依存的な方法を使用すると、バチルス種が Thua Nao の主要な微生物であることが報告されています4。 しかし、トゥア ナオは、容易に培養することができない天然の微生物叢の混合物から作られています。 混合微生物叢による発酵プロセスにより、微生物が互いに助け合って、ペプチド、ビタミン B、脂肪酸、短鎖脂肪酸 (SCFA) などの栄養と健康に関連する重要な物質を生成することができます。 微生物叢による大豆の消化により、SCFA、つまり酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩が生成されます。これらは結腸粘膜細胞にとって必須の栄養素として機能し、粘膜の増殖と血流 5 を刺激し、糖レベル 5、代謝 6、コレステロールレベル 7 を制御します。 したがって、トゥア ナオは、健康に有益な重要な物質、プレバイオティクス、細菌の優れた供給源であると考えられています。

トゥアナオはタイ北部のさまざまな地域で生産されています。 しかし、トゥアナオのさまざまな地域の細菌群集に関するデータはまだ限られています。 細菌群集を研究することで、トゥア ナオにおける発酵細菌の役割と機能的特性をより深く理解できる可能性があります。 自然発酵に使用される微生物は、大豆の栽培に由来します。 したがって、我々は、異なる大豆栽培地域または地理的条件が微生物叢の構成、そして最終的にはSCFAの構成に影響を与える可能性があると仮説を立てました。 納豆は発酵大豆でもあるため、他の発酵食品 (発酵魚や漬物など) と比較して優れた対照となる可能性がありますが、スターター培養物としてバチルスが添加されています。 これに対処するために、我々はまず、文化に依存しないアプローチ（すなわち、16S rRNA 遺伝子配列決定）を使用して、タイ北部の 6 つの異なる地域からトゥア ナオの細菌分類群を特定しました。 次に、気液クロマトグラフィーを用いて、細菌分類群とトゥアナオ中のSCFAの種類および量との相関関係を分析しました。 その結果、トゥアナオの生産品質を向上させるためのスターター培養物として使用できる有益な細菌が明らかになりました。

タイ北部の 6 つの県の 37 の村から、湿った発酵大豆と乾燥した発酵大豆の両方からなる 65 個のトゥア ナオ サンプルが収集されました。 市販の納豆も、タイのスーパーマーケットで入手した非伝統的発酵大豆サンプル (対照; n = 1) として使用しました。 図 1 は、各県のサンプル数を示すタイの地図を示しています。

タイ北部における乾燥したトゥアナオと湿ったトゥアナオのサンプリング場所と数。 円の中心の数字は各州の村の数を表し、オレンジ色と緑色の数字はそれぞれ各州の乾燥サンプルと湿潤サンプルの数を示します。 マップは Google データスタジオからダウンロードされ、追加のグラフとポインターは Microsoft Excel v16.66.1、Microsoft PowerPoint v16.66.1、および Inkscape v1.1 を使用して描画されました。

16S rRNA 遺伝子を使用した Illumina シークエンシングによって生成された生の 250 bp ペアエンドリード配列の中央値は 66,438 (範囲 36,740 ～ 82,116) でした。 前処理後、シーケンス数の中央値は 48,645.5 (範囲 31,864 ～ 60,876) に減少しました。 次に、アンプリコン配列バリアント (ASV) 法に基づいて配列を 652 個の特徴にクラスター化しました。配列長のほとんどは 253 bp で、16S rRNA 遺伝子の V4 領域のおおよそのサイズに相当します。 補足ファイル S1 は、門および属レベルでの分類学的存在量表を示しています。

66 個の発酵大豆サンプル (湿った Thua Nao 30 個、乾燥した Thua Nao 35 個、および納豆 1 個) が取得され、16S rRNA 遺伝子配列の多様性に基づいて細菌群集が分析されました。 両方のタイプの発酵大豆で 4 つの門が同定されました。 ファーミクテス門は、乾燥型 (95.98% + 11.55%)、湿潤型 (88.42% + 15.46%)、および両方 (92.66% + 13.71%) の門で最も一般的でした (図 2A)。 プロテオバクテリア、アクチノバクテリオタ、バクテロイドータの相対存在量は、湿潤サンプルではそれぞれ 10.26%、0.85%、0.47%、乾燥サンプルではそれぞれ 3.85%、0.08%、0.09% でした (図 2B)。 12 属の相対存在量は 1% 以上でした (図 2D)。 バチルス属は、乾燥型 (86.41% + 16.41%)、湿潤型 (47.19% + 30.63%)、および両方 (66.94% + 32.25%、図 2D) のタイプにおいて優勢な属でした。 興味深いことに、乳酸桿菌、エンテロコッカス、およびグロビカテラは湿ったサンプルに豊富に含まれていました。

分類学的組成物の相対存在量パーセントを、門 (A) および属 (B) レベルで乾燥大豆 (n = 35) と湿潤発酵大豆 (n = 30) の間で、および門 (C) および属レベルで 6 つの州間で比較しました。 (D) レベル。

発酵大豆のすべてのマイクロバイオームプロファイルについてアルファ多様性を推定し、シャノンの多様性（図3A）、シンプソンの多様性（図S1B）、ピルー指数（図S1C）、フェイスの系統的多様性に基づいて乾燥大豆と湿式発酵大豆の間で比較しました。 (図S1D)ウィルコクソン順位和検定を使用します。 すべてのアルファ多様性指標は、湿式発酵大豆の微生物の多様性が乾燥発酵大豆の微生物多様性よりも大幅に高いことを示しました。 発酵大豆サンプル間のベータ多様性を測定しました (図 3 および S2)。 発酵大豆の種類間の違いは、PERMANOVA テストを使用して評価されました (図 3B)。湿った発酵大豆と乾燥した発酵大豆と納豆では異なる微生物叢パターンがあることが示されました (P = 1e−04)。 乾燥発酵大豆と湿潤発酵大豆の間で異なる豊富な分類群は、カットオフ基準 P < 0.05 で特定されました (図 3C および D)。

乾燥大豆（赤、n = 35）と湿潤発酵大豆（青、n = 30）および納豆（緑、n = 1）の細菌多様性の比較。 シャノンの多様性に基づく乾燥大豆と湿潤発酵大豆間のアルファ多様性の統計的有意性検定 (A)。 Bray-Curtis の非類似性と PERMANOVA (B) に基づく、乾燥および湿潤発酵大豆および納豆間のベータ多様性。 ANCOM-BC 法を使用した、門 (C) および属 (D) レベルでの乾燥大豆と湿式発酵大豆間の存在量の差分析。 Q 値は、誤検出率 (FDR) 用に調整された P 値を表します。

発酵大豆の細菌組成から、ランパーンに最も多くの細菌属（14 属）があり、相対存在量が 1% 以上であることが示され、チェンマイ、チェンライ、パヤオ、メーホンソン、ランプーンがそれに続きました（図 2D）。 興味深いことに、チェンライとパヤオでは他の県に比べてプロテオバクテリアの存在量が低かった(図2C)。

シャノンの多様性、シンプソンの多様性、ピルー指数、フェイスの系統的多様性に関するアルファ多様性は、クラスカル・ウォリス検定を使用して6つの州間で比較されました（図S3）。 統計結果は、フェイスの系統発生的多様性に基づいて、湿潤条件では 6 つの州間の微生物の多様性が大きく異なることを示しました (P = 0.0011、図 4A)。 しかし、乾燥状態では、アルファ多様性は 6 つの州間で有意な差はありませんでした (P = 0.06、図 4B)。 チェンライ、チェンマイ、ランパーンのアルファ多様性は、ランプーン、メーホンソン、パヤオよりも高かった。 任意の 2 つのサンプル間の差異は、Bray-Curtis の相違度、Jaccard 距離、加重 UniFrac 距離、および加重されていない UniFrac 距離に基づいて測定されました (図 S4)。 4 つの指標に基づくベータ多様性は、主座標分析 (PCoA) プロットを使用して分析および視覚化されました (図 S4)。 PERMANOVA は、6 つの州の細菌プロファイルに有意な差があることを示しました (P = 0.001、図 4C および S3)。

地方間の発酵大豆における細菌の系統的多様性と相違点の比較。 クラスカル・ウォリス検定を使用した、湿潤条件（n = 30）（A）および乾燥条件（n = 35）（B）におけるフェイスの系統発生的多様性に基づく、州間のアルファ多様性の統計的有意性検定。 6 つの州の乾燥大豆および湿潤発酵大豆と日本の納豆 (n = 1) の間のベータ多様性を、Bray-Curtis の非類似性に基づいて PERMANOVA によって分析しました (C)。

発酵大豆のSCFAレベルを測定した。 酢酸塩 (P = 2.8e−08)、プロピオン酸塩 (P = 0.0044)、酪酸塩 (P = 0.0021)、およびイソ吉草酸塩 (P = 0.017) は、乾燥発酵大豆 (n = 30) よりも湿った発酵大豆 (n = 30) の方が多かった。 35) Wilcoxon 順位和検定に基づく (図 5A)。 発酵大豆の乾燥形態と湿潤形態は、イソ酪酸塩、吉草酸塩、ヘキサン酸塩、または総 SCFA について有意な差はありませんでした (図 5A)。 発酵大豆の乾燥および湿潤形態における発酵濃度は、他の SCFA よりも酢酸の方が高かった (図 5A)。 酢酸塩とイソ吉草酸塩はチェンライとランパーンで最も豊富でした。 チェンライではイソ酪酸と総SCFAが優勢でした（図5B）。 ランパーンとチェンマイには、それぞれプロピオン酸塩と酪酸塩が最も多量に含まれていました (図 5B)。 チェンマイはヘキサン酸塩の量が最も多かった (図 5B)。 6 つの州すべてで、トゥア ナオでの酢酸発酵濃度が最も高かった (図 5B)。

発酵大豆中のSCFA濃度の比較。 乾燥大豆 (n = 35) と湿潤発酵大豆 (n = 30) をウィルコクソンの順位和検定 (A) を使用して比較し、P < 0.05 のカットオフでクラスカル-ワリス検定を使用して 6 つの州間で評価しました (B)。

スピアマンの相関係数に基づく細菌存在量とSCFA濃度の間の相関（R）は低く、有意ではありませんでした（P > 0.05）（図6および表S4）。 最大の R 値は、Weissella (R = 0.45)、Lactobacillus (R = 0.47)、または Clostridium_sensu_stricto-18 (R = 0.46) の存在量と酢酸濃度の増加の間で見つかりました (表 S4)。 相対的な豊富さのカットオフ値 1% を使用すると、ワイセラはチェンライ、ランパーン、パヤオで発見されました。 乳酸菌はチェンライとランパーンで見つかり、Clostridium_sensu_stricto-18 はランパーンでのみ見つかりました（表S4）。 プロピオン酸レベルを上げるには、Globicatella (R = 0.40)、Ignatzschineria (R = 0.5)、Clostridium_sensu_stricto-15 (R = 0.44)、Clostridium_sensu_stricto-18 (R = 0.66)、パエナルカリゲネス (R = 0.40)、またはブドウ球菌 (R = 0.46) ) の存在量は、発酵大豆中で最大の細菌メンバーでした (表 S4)。 グロビカテラとクロストリジウム_センス_ストリクト-15はランパーンで発見されました。 Ignatzschineria はランパーン、チェンマイ、チェンライで発見されました。 パエナルカリゲネスはランパーンとチェンマイで見つかり、ブドウ球菌はチェンマイとパヤオで相対存在量が 1% 以上で見つかりました（表 S3）。 他の細菌存在量と比較すると、グロビカテラ (R = 0.44)、イグナツスキネリア (R = 0.56)、コリネバクテリウム (R = 0.49)、スフィンゴバクテリウム (R = 0.49)、Clostridium_sensu_stricto-15 (R = 0.50)、Clostridium_sensu_stricto-18 (R = 0.59) ）、バゴコッカス（R = 0.41）、パエナルカリゲネス（R = 0.40）、ブドウ球菌（R = 0.44）、コマモナス（R = 0.40）が酪酸濃度の増加に最も大きな影響を与えました（表S4）。 さらに、総SCFAの増加は、ワイセラ菌（R = 0.44）および乳酸菌（R = 0.46）の存在量の増加に基づいていました（表S4）。 コリネバクテリウムはチェンマイで発見されました。 スフィンゴバクテリウムはランパーンで発見された。 バゴコッカスはランパーンとチェンマイで、コマモナスはメーホンソンで発見され、いずれも相対存在量が 1% 以上でした（表 S3）。

スピアマンの相関係数を使用した、サンプル全体の総存在量が 0.1% を超える最高の SCFA と優勢な細菌属との間のペアごとの相関。

この研究では、タイ北部のさまざまな地域から採取したトゥア・ナオの微生物叢を特徴づけ、SCFAを合成する可能性のある有益な細菌を特定しました。 私たちは、トゥアナオの生産に使用される原材料（つまり、大豆と各地域の自然植物相）が多様な細菌分類結果をもたらすだろうと仮説を立てました。 また、培養物に依存しない方法である 16S rRNA 遺伝子配列決定を使用して、湿潤および乾燥の 2 種類の Thua Nao を評価しました。 門レベルでは、Firmicutes が最も豊富で、湿った発酵大豆製品と乾燥した大豆発酵製品の両方で一般的でした (図 2A)。 ファーミキューテスのメンバーには主に、腸内細菌と人間の健康の関係において重要な役割を果たす有益な細菌が含まれています。 ファーミクテスのメンバーの中には、マメ科植物の食物繊維を発酵させて、SCFA などの最終代謝産物を生成することができる8。 さらに、存在量 1% 以上のファーミクテス属の主な属を分析しました。 今回の結果は、湿ったサンプルと乾燥したサンプルの両方でバチルス属が最も豊富であることを示唆しており、これは以前に報告された微生物組成 2、4、9 と一致していました。 予想通り、納豆サンプルではバチルス属が主な細菌属であり、この研究では対照でした。 しかし、納豆のサンプルは 1 つしかなかったため、納豆と Thua Nao の間で統計的検定を行うことはできませんでした。

湿ったトゥア ナオと乾燥したトゥア ナオの細菌多様性の違いを考慮して、存在量差分析により、乳酸生成細菌 (LAB) が豊富に存在することが示されました。 LAB 接種剤は、さまざまな動物および野菜製品の生産、および発酵食品の風味、香り、食感の開発に使用されます10。 湿潤サンプルと乾燥サンプル中の LAB の比率の違いが、保存された Thua Nao における LAB の生存率の要因となる可能性があります。 湿ったサンプル中に非常に豊富に存在する 2 つの LAB 属、ラクトバチルス属とエンテロコッカス属は、大豆タンパク質を加水分解できることが報告されています 11,12。 乳酸菌属は人間や動物のサプリメントのプロバイオティクスとして一般的に使用されており、乳酸菌の混合培養物は大豆粕の発酵に使用されます13。 一部の腸球菌は病原性決定因子と考えられていますが、これらの細菌にはいくつかの良い特徴もあります。 多くの有効な腸球菌株が、さまざまな発酵製品のスターター候補として報告されています。 スターター培養物または共培養物としての腸球菌の使用は大幅に増加しています。 しかし、大豆基質と他の主要な細菌（バチルス、LAB、その他の細菌メンバーなど）、および他の微生物（酵母やカビなど）の混合された天然因子が、大豆に独特の風味、香り、食感、栄養価を生み出す可能性があります。濡れたトゥア・ナオ。

トゥアナオは、調理済み食品の風味を増す材料として使用でき、もち米や米と一緒に直接食べることができるため、タイ北部で人気の発酵食品です1。 生大豆の繊維の種類と量、自然の微生物叢、環境、発酵期間など、トゥアナオの製造におけるさまざまな要因が州によって異なり、その結果、トゥアナオの異なるマイクロバイオームプロファイルと異なる味が生じます。 我々の結果は、ランパーン、チェンマイ、チェンライのトゥアナオのサンプルは、湿潤状態ではランプーン、メーホンソン、パヤオのサンプルよりも微生物の多様性が高いことを示しています（図4A）。

Thua Nao には高濃度の非消化性炭水化物が含まれており、胃や小腸の内因性酵素によって消化されませんが、腸内で有益な微生物の発酵基質となる可能性があり、プレバイオティクスと考えられています 14、15、16。 発酵食品の生産において天然の有益な微生物を使用した発酵には、非消化性炭水化物を糖に加水分解することが含まれ、その後発酵されて主に SCFA、H2 および CO2 が生成されます 16,17。 いくつかの研究では、SCFA の種類と量は細菌の消化性と繊維の発酵性と粘度に大きく依存することが報告されています 16,17。 3 つの主要な SCFA、酢酸 (C2)、プロピオン酸 (C3)、および酪酸 (C4) は、腸内微生物の増殖と人間の生理学的効果のためのエネルギーの放出を助けます 16。 SCFA は揮発性であり、食物繊維の嫌気性発酵によって生成されます 6,18。 これらの代謝産物は、おそらく乾燥プロセス中の揮発性と嫌気性酵素活性の破壊のため、乾燥したThua Naoよりも湿ったThua Naoの方が有意に高かった(図5A)。

酢酸は、湿ったサンプルと乾燥したサンプルの両方で最も豊富な SCFA でした。 以前の研究により、固体発酵における主な酢酸生産者には、嫌気性クロストリジウム菌、イグナチネリア菌、LAB および好気性酢酸菌 (AAB) が含まれることが明らかになりました 20,21,22。 この研究では、Thua Nao に含まれる Clostridium sensu stricto、Ignatzschineria、LAB (すなわち、Lactobacillus、Pediococcus、Streptococcus、Enterococcus、Globicatella、Vagococcus、および Weissella)、および AAB (すなわち Acetobacter) が発酵中の酢酸生成に関連している可能性があります。 チェンライとランパーンで見つかった 2 つの最高濃度の酢酸は、​​LAB、AAB、Ignatzschineria、および Clostridium spp の優勢に対応していました。

3 つの主要なプロピオネート生成経路は、コハク酸、アクリレート、プロパンジオールの経路です23。 嫌気性菌であるプロピオニバクテリウムおよびクロストリジウムは、コハク酸経路を介した潜在的なプロピオン酸生産者として研究されてきました 20,24。 相関分析により、プロピオン酸濃度は、グロビカテラ、イグナツスキネリア、クロストリジウム センス ストリクト、パエナルカリゲネス、およびブドウ球菌の存在量と密接に関連していることが示されました。 Clostridium、Ignatzschineria、および Paenacalaligenes は、潜在的なプロピオン酸生産者であると報告されています 25,26。 Ignatzschineria と Paenacalaligenes は、ヒトの感染症に関与するとされるプロテオバクテリア門に属しますが 27、これらの属は乾燥トゥア ナオ中に非常に少量 (< 1%) 検出されました (表 S2)。 最も多量のプロピオン酸が観察されたのはランパーン、次いでチェンマイで、これはグロビカテラ、クロストリジウム・センス・ストリクト、およびブドウ球菌の相対量が最も多かったことに対応していた。

相関分析の結果、酪酸濃度は、グロビカテラ、イグナチネリア、コリネバクテリウム、スフィンゴバクテリウム、クロストリジウム センス ストリクト、バゴコッカス、パエナルカリゲネス、ブドウ球菌、およびコマモナスの存在量と密接に関連していることが示されました。 以前の研究では、酪酸塩がグロビカテラ、バゴコッカス、ブドウ球菌などの LAB の発酵から生成される可能性があることが示されています。 バチルス属; コリネバクテリウム、コマモナス、スフィンゴバクテリウム、イグナッチネリア; および Clostridium sensu stricto28、29、30。 酪酸の量が最も多いのはチェンマイ、次いでランパーンで、これはチェンマイのコリネバクテリウム、チェンマイとランパーンのスフィンゴバクテリウムとバゴコッカス、ランパーンのグロビカテラとクロストリジウム・センス・ストリクト、そしてメーのコマモナスの相対存在量が最も高いことに相当した。ホンソンさん。 相関分析により、総SCFA濃度がワイセラおよび乳酸菌の相対存在量と密接に関連していることが示されました。 チェンライで観察された総SCFAの最高量は、ワイセラ菌と乳酸菌の相対存在量が最も高かったことに対応していた。

私たちの結果は、タイ北部の湿ったトゥアナオと乾燥したトゥアナオの両方が潜在的なSCFAの供給源であることを示しています。 特に、私たちはアンプリコンベースのマイクロバイオームアプローチを使用してトゥアナオの細菌群集を観察し、その結果は属レベルの細菌に基づいていました。 この研究は、トゥア・ナオのSCFAと微生物叢の関連性についての洞察を提供し、生涯の健康を調節するための補助食品としてSCFAが豊富な発酵大豆生産のためのスターター培養物を開発するために使用できる可能性がある。 SCFA発酵最終産物に対するThua Naoのマイクロバイオームの影響は、ショットガンメタゲノミクス、ゲノム配列決定、メタボロミクスなどの他のアプローチを使用してさらに調査される必要があります。

30 個の湿潤サンプルと 35 個の乾燥サンプルからなる 65 個のトゥア ナオ製品 (天然発酵大豆サンプル) が、タイ北部 6 県の 36 の村から収集されました: チェンライ (乾燥 14 個、湿式 5 個)、チェンマイ (乾燥 5 個、湿式 5 個) ）、メーホンソン（ドライ5、ウェット5）、ランパーン（ドライ5、ウェット8）、ランプーン（ドライ5、ウェット5）、パヤオ（ドライ1、ウェット2）。 また、対照として膨張剤を使用して発酵させた日本産大豆である納豆も使用しました。 36 村中 27 村で、湿った状態と乾燥した発酵大豆のサンプルを収集しました。 重量を決定するために水分含量を分析した。

DNeasy® Power Food® Microbial Kit (Qiagen, MD, USA) を使用して、67 サンプルから全ゲノム DNA を抽出しました。 DNA濃度は、Nanodrop装置(Thermo Scientific、USA)を使用して測定した。 DNA の完全性は 1% アガロースゲルでモニタリングしました。 抽出された DNA サンプルは、PCR 増幅、ライブラリーの調製、および配列決定のために Genome Quebec Innovation Center (マギル大学、モントリオール、ケベック州、カナダ) に送られました。 保存プライマー 515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3') および 806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3') を使用して PCR を実行し、16S rDNA 遺伝子の V4 領域を生成しました。 FastStart® High Fidelity PCR System (Roche、マンハイム、ドイツ) を 26 増幅サイクルに使用しました。 DNAテンプレートを含まないブランクサンプルをネガティブコントロールとして使用しました。 ライブラリーは、Illumina MiSeq プラットフォーム上で同社のプロトコールに従って配列決定され、250 bp のペアエンドリードが生成されました。 10 種の細菌を含む模擬コミュニティ (Zymo Research、米国) を陽性対照として使用しました。

SCFA 分析は、31、32 の方法に若干の変更を加えたガスクロマトグラフィーを使用して実行されました。 粉砕した Thua Nao サンプル 1 グラムを 3 mL の内部標準溶液 (ヘプタン酸、5.04 μM/g サンプル) と混合しました。 サンプルをボルテックスし、2,500 × g、4 °C で 10 分間遠心分離し、10 μL の 1 M リン酸を 300 μL の上清に加えました。 上清を孔径 0.45 µm のナイロンフィルターで濾過し、濾液 0.2 μL を水素炎イオン化検出器 (GC-FID、モデル 7890A、Agilent Technologies、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を備えたガスクロマトグラフに注入しました。 ）およびキャピラリカラム（DB-FFAP、30 m × 0.53 mm × 0.5 μm）。 初期オーブン温度を 90 °C で 1 分間保持し、その後 20 °C/min で 190 °C まで上昇させ、2.5 分間保持しました。 インジェクターと検出器の温度は 210 °C に設定されました。 キャリアガスとしてヘリウムを使用し、ガス流量とセプタムパージ速度はそれぞれ 7.7 mL/min と 3.0 mL/min でした。 計算には、酢酸塩、プロピオン酸塩、酪酸塩、イソ酪酸塩、吉草酸塩、イソ吉草酸塩、ヘキサン酸塩、さらにフェノールおよび p-クレゾールを含む標準 SCFA 混合物を使用しました。 SCFA濃度はμM/gで計算されました。 内部標準に基づいて量を調整し、各 SCFA 標準の相対ピーク面積に基づいて定量を実行しました。

配列は、FASTQ 形式の 250 bp ペアエンド リードでした。 シーケンスは QIIME2-2022.233 にインポートされました。 アダプターとプライマーは、q2-cutadapt を使用してフォワードリードとリバースリードの両方の先頭からトリミングされました。 シーケンスは順方向と逆方向の位置で切り詰められました。 次に、ペアエンドリードを重複領域とマージして、V4 16S rRNA を表す配列にし、q2-dada2 を使用してキメラ配列を廃棄しました。 前処理された配列は、アンプリコン配列バリアント法に基づいて特徴にクラスター化され、サンプル内の特徴数が存在量テーブルに整理されました 34。 特徴は SILVA v13835 に基づいて分類学的に注釈が付けられました。 すべてのサンプルを同じ数の読み取りと比較できるようにするために、希薄化正規化が適用されました。 すべてのサンプルの分類学的存在量は、q2-classify-sklearn を使用して計算されました。

属レベルでの分類学的存在量を使用して、多様性指標を計算しました。 シャノンの多様性、シンプソンの多様性、ピルーの均一性、およびフェイスの系統的距離に基づくアルファ多様性が、すべてのサンプルについて推定されました。 アルファ多様性は、Wilcoxon の順位和検定を使用して大豆の種類間で比較され、Kruskal-Wallis 検定を使用して州間で評価されました。 複数の仮説修正を伴うウィルコクソンの順位和検定を使用して、州間のペアワイズ比較が行われました。 Bray-Curtis の非類似性、Jaccard 指数、UniFrac 系統距離、および加重 UniFrac 系統距離に関するベータ多様性をすべてのサンプルについて計算しました。 PCoA は Phyloseq v1.36.036 を使用して実行されました。

ANCOM-BC v1.2.237,38,39 は、P < 0.05 の基準で、湿った発酵大豆と乾燥した発酵大豆の間で量が異なる微生物を同定するために実行されました。

相対存在量の合計が 0.1% 未満の分類群は、分類表から除外されました。 分類学的プロファイルと SCFA 濃度の間のペアごとの相関は、Spearman の相関係数を使用して計算され、ggplot2 v3.3.5 を使用して視覚化されました。

Wilcoxon 順位和テストと Kruskal-Wallis テストは、R v4.1.0 で実行されました。 箱ひげ図と PCoA プロットは、ggplot2 v3.3.5 を使用して作成されました。

配列データは、BioProject アクセッション番号 PRJNA852866 の下、アクセッション番号 SRR20217885 ～ SRR20217951 で NCBI SRA に提出されました。

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この原稿の草稿を編集してくださった Edanz (www.edanz.com/ac) の Traci Raley、MS、ELS に感謝します。

PJI は、BRAND の Health Research Award 2019 と MU-KMUTT Biomedical Engineering and Biomaterials Consortium Grant 2021 によって支援されました。

これらの著者、Thidathip Wongsurawat とSawannee Sutheeworapong も同様に貢献しました。

マヒドン大学医学部シリラート病院研究部医療生物情報学部門、バンコク、10700、タイ

ティダティップ・ウォンスラワット & ピルーン・ジェンジャルーンプン

シリラート ロングリード ラボ (Si-LoL)、医学部シリラート病院、バンコク、10700、タイ

ティダティップ・ウォンスラワット & ピルーン・ジェンジャルーンプン

システム生物学およびバイオインフォマティクス研究所、パイロット プラント開発およびトレーニング研究所、モンクット王工科大学トンブリ校、バンコク、10150、タイ

サワニー・スティーウォラポン

カセサート大学農業産業学部食品科学技術学科、バンコク、10900、タイ

スビモル・チャロンシッディ

バイオインフォマティクスおよびシステム生物学プログラム、生物資源および技術学部および情報技術学部、モンクット王工科大学トンブリ校、バンコク、10150、タイ

アフマド・ヌール・アッディン・コイリ

分子熱帯医学および遺伝学部門、熱帯医学学部、マヒドン大学、バンコク、10400、タイ

スパチャイ・トパヌラック

マヒドン大学熱帯医学部原虫学部、バンコク、10400、タイ

チャンティラ・スティコンチャイ

マヒドン大学熱帯医学学部熱帯栄養食品科学科、バンコク、10400、タイ

ポーンルツァミ・ジンタリス

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著者全員が原稿をレビューしました。

Thidathip Wongsurawat または Pornrutsami Jintaridth への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Wongsurawat、T.、Sutheeworapong、S.、Jenjaroenpun、P. 他タイの伝統的な発酵大豆のマイクロバイオーム分析により、短鎖脂肪酸に関連する細菌分類群が明らかになりました。 Sci Rep 13、7573 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34818-0

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受信日: 2022 年 8 月 27 日

受理日: 2023 年 5 月 8 日

公開日: 2023 年 5 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34818-0

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